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复旦基因魔剪获重要进展

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来源: 作者: 2019-05-16 20:43:35

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复旦大学生命科学学院、遗传工程国家重点实验室黄强课题组与卢大儒课题组合作,用冷冻电镜单颗粒三维重构方法解析了CRISPR-Cas9的DNA剪切活性结构。相干研究成果日前发表于《自然—通讯》。

CRISPR-Cas9技术可方便地对基因组DNA进行高效、特异性的切割,因此被称为“基因魔剪”。过去几年,众研究机构陆续解析了多个“Cas9-sgRNA-DNA靶链”的三元复合物晶体结构。然而,这些复合物结构并没有完全揭露出真正的DNA剪切活性构象,人们对CRISPR-Cas9如何通过HNH与RuvC核酸酶域切割DNA单链的份子机制还很不明确。因此,取得CRISPR-Cas9的剪切活性结构成为揭示该系统DNA剪切机理的关键。

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究人员首先构建了酿脓链球菌Cas9酶、sgRNA和DNA的三元复合物,然后用冷冻电镜单颗粒三维重构方法解析该复合物的溶液结构,获得了一个5.2埃分辨率的冷冻电镜结构。复合物结构的原子模型显示,在已解析的所有结构中,该复合物的HNH酶活性中心最接近DNA链的切割位点;份子动力学摹拟及点突变实验表明,该复合物的HNH和RuvC核酸酶活性中心的催化氨基酸可以与DNA解旋单链构成切割反应所需构象。因此,研究取得的复合物结构是CRISPR-Cas9的DNA剪切激活构象,为全面揭示剪切机理提供了关键的活性结构信息,并为运用蛋白质工程技术优化该系统、下降其脱靶效应提供了重要的结构生物化学基础。

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